东北红豆杉杂交种鉴定及遗传多样性分析

发布时间：2018/11/8

王丹丹1，张彦文1，2 ( 1. 辽东学院 农学院，辽宁 丹东118003； 2. 东北师范大学 草地研究所， 吉林 长春 130024 ) [摘要] 本研究采用EST-SSR分子标记技术对东北红豆杉杂交种进行快速鉴定和遗传多样性分析，建立东北红豆杉杂交种快速鉴定体系，探究东北红豆杉杂交种群体的遗传信息，以期为保护东北红豆杉种质资源及其新品种选育提供科学依据。采用EST-SSR标记对126个东北红豆杉杂交样本及其亲本基因组DNA进行扩增，分析杂交种与其父母本间扩增谱带的多态性，以此鉴定杂交种的真伪，并结合形态学特征对杂交后代的遗传多样性进行分析。结果显示，从已开发的EST-SSR引物中筛选出12对多态性较高的引物，多态性比率为83.5%，平均PIC值为0.668，表现出了较高的多态性；平均观测杂合度（Ho）为0.440（0.257～0.587），平均期望杂合度为0.659（0.523～0.796），可见，期望杂合度比观测杂合度要高；遗传分化系数（FST）平均值为0.136（0.011～0.213），表明红豆杉杂交种群体间遗传分化程度适中，说明基因在杂交群体间流动较大，群体特征相对稳定；采用2对红豆杉多态性EST-SSR引物杂交种材料进行鉴定分析，*终从126份杂交后代样本中鉴定出99个真杂交样本。可见，EST-SSR分子标记用于红豆杉杂交种鉴定及遗传多样性分析是可行的。 [关键词] 东北红豆杉；杂交种；EST-SSR标记；表型差异；遗传多样性 [中图分类号] Q663.4 [学科代码] 180.5155 [文献标识码] A 红豆杉又名紫杉、赤松柏，常绿乔木，隶属于红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus）。红豆杉起源于古老的第三纪，是第四世纪冰川后遗留下来的世界珍稀濒危植物，在地球上已有250万年的历史，因此，又称之为植物王国里的“活化石”。红豆杉全世界共11种，自然分布*少，除澳洲的Austrotaxus Spicata产于南半球外，其余主要分布于北半球温带、寒温带、热带及亚热带高山地区，目前我国有4个种和1个变种，即云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉（变种）。红豆杉的树皮和树叶中富含紫杉醇，对多种晚期癌症疗效突出，被称为“治疗癌症的*后一道防线” [1]。 由于红豆杉属植物种群竞争力差，天然更新缓慢及地理分布*限等因素，导致红豆杉属植物资源储备量日渐稀少，尤其近年来，随着抗癌药物紫杉醇的开发利用，对红豆杉属植物的需求日益增大，使其资源遭到了严重破坏，野生种群已濒危，因此，世界各国将其列入保护树种，被称为“黄金树”[2]。我国也于1999年8月4日批准颁发的“*重点保护野生植物名录（*批）”中，将我国5种红豆杉属植物全部列入*一*保护植物。由于野生资源有限，而紫杉醇强大的市场需求量，加之各地对红豆杉属植物的推广应用有限，所以急需培育高产、优质、适应性强的红豆杉品种，以达到资源的可持续利用[3-6]。 [收稿日期] [基金项目] 中央财政林业科技推广示范资金项目（辽[2017]06号），辽东学院青年基金（2017QN050）。 [作者简介] 王丹丹（1982—），女，讲师，主要从事分子生物学的研究；E-mail:wangdandansq@sina.com。 通讯作者：张彦文，男，教授，主要从事繁殖生态学研究；E-mail:yanwen0209@163.com。 杂交（Hybrid）为具有差异的物种或具有相同基因型的个体进行有性交配的过程，是高等植物进化和新物种形成的主要方式之一[9]。杂交后的杂种F1代可能会在生长势、生活力、抗逆性、产量、品质等方面远超其亲本，即为杂种优势[10-13]。与传统的选育引种相比红豆杉属植物的杂交育种更有利于综合双亲的优良性状，并亦缩短培育周期。育种成败的关键是理想亲本的选择，亲本的优势特征和双亲的杂交配合程度在优良品种的选育中起到决定性作用。由于红豆杉属植物为雌雄异株，风媒授粉，杂交过程中若隔离不严密，则容易出现杂交种生物性状混杂现象，因此有必要对杂交后代进行鉴定分析[14]。对杂交后代的传统鉴定方法为形态学鉴定，同一生境下，对不同种质资源进行形态学鉴定可以快速分析其遗传差异，但形态学鉴定*易受到环境和人为因素的影响，且田间测试周期较长，成本较高，而分子标记技术因其受环境饰变小、可重复性强、操作简单、快捷等优势，已被广泛应用在遗传育种研究中。常用的分子标记SSR、SARP和RAPD等均被用于不同植物杂交后代的鉴定中，其中EST-SSR (Expressed Sequence Tag- Simple Sequence Repeats）分子标记为共显性、扩增谱带少、易识别、统计方便，结果可靠且重复性好、以及EST来自DNA编码区，序列保守性相对较高，被认为是一种较为理想的鉴定杂交种的方法[15-17]。本试验采用EST-SSR分子标记技术对东北红豆杉杂交种进行快速鉴定和遗传多样性分析，建立东北红豆杉杂交种快速鉴定体系，探究东北红豆杉杂交种群体的遗传信息，以期为保护东北红豆杉种质资源及其新品种选育提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料 本试验材料野生乔木型东北红豆杉父本（Taxus cuspidata S. et Z.）和栽培灌木型日本红豆杉母本，本文试验材料日本红豆杉又名矮紫衫（Taxus cuspidate var. nana Rehd），为东北红豆杉的变种。2012年春在丹东市元宝区黑沟村三组一处沟叉栽培25株雌性日本红豆杉，另配置2株野生雄性乔木型东北红豆杉，园边1公里内无任何栽培和野生红豆杉；在2013年获得红豆杉种子约5斤，然后对种子进行沙藏处理，于2014年秋季播种，2015年春季出苗，2017年选取126株杂交后代进行EST-SSR鉴定。 1.2 红豆杉基因组DNA提取与纯度检测 采用CTAB法提取红豆杉基因组DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度，模板用于分析时稀释为40ng/μl，母液置于-20℃备用[18-20]。 1.3 红豆杉EST-SSR引物的开发与筛选 本研究从美国*生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Infoemation, NCBI）EST数据库下载甜樱桃的*EST序列，分别利用Blastclust、est_timmer、misa.pl和primer 3批量设计EST-SSR 引物[21-22]；用Blast对所开发的引物进行比对验证，*后引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。试验采用亲本和杂交种的基因组DNA进行引物筛选，以能扩增出清晰、稳定、可重复性条带的引物作为下一步杂交种鉴定以及聚类分析的核心引物。 1.4 红豆杉EST-SSR扩增 PCR扩增反应总体积为25 μl：dNTPs (2.5 mmol·L-1) 1μl，引物（10 μmol·L-1）各1μl，DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶（2.5U·μl-1）0.2μl，Mgcl2 (1.5 mmol·L-1) 1.5μl，10×缓冲液 2.5μl，加ddH2O至25μl；PCR扩增程序为：95℃预变性15 min；95℃变性30 s，59℃或60℃退火90 s，72℃延伸1 min，共30个循环；60℃延伸30 min。扩增产物用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，170V电压，70 min，银染显色。 1.5 红豆杉F1代杂交种真实性鉴定 采用已筛选出的能在父母本间产生特异性条带、且稳定性及多态性较高的引物对杂交种进行真伪鉴定分析。若杂交种扩增谱带中具有父本特异性条带，即为真杂交种；若只有母本特异性条带而无父本特异性条带，即为自交种或伪杂交种。 1.6 红豆杉杂交种群体EST-SSR扩增产物的多态性 根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，对每对引物生成的不同带型直接编号（按照分子质量从小到大的顺序记录），扩增条带在相同迁移位置上[23]，有带记为1，无带记为0，存入Microsoft excel中，采用POPGENE version 1.32软件对每一个多态位点进行遗传多样性分析，包括扩增总条带数N，多态性条带数Np，多态性比率PPB，观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、遗传分化系数(FST或GST)、基因流(Nm)（Nm=0.25（1－FST）/FST）等；利用公式： ，Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数，计算生物多态信息含量PIC[24-28]。 2 结果与分析 2.1 DNA完整性检测 采用CTAB法，均提取到高质量东北红豆杉基因组DNA；用紫外分光光度计检测，其OD260/OD280比值均介于1.8～2.0之间，适于后续实验；1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性如下(图1)： 图1 基因组DNA完整性电泳图谱 Fig 1 Electrophoresis of genomic DNA integrity 2.2 红豆杉F1代杂交种真实性鉴定 从已开发的引物中筛选出12对条带清晰、带型稳定、多态性高的EST-SSR引物（表1），用于红豆杉F1代杂交种真实性鉴定。共扩增出4种带型，即“杂合型”、“父本型”、“母本型”和“其他型”，其中父本与母本均有特征带，并且后代具有父本特征带的即为真杂交种；若后代不具有父母本特征带且与母本的电泳条带有差异的子代，则可能为自交种或杂交种，有待进一步采用引物联合法鉴定分析。采用能扩增出父本特征带的引物Tc 6对126份红豆杉杂交种进行鉴定，将能扩增出父本特征带的单株评定为真杂交种。结果显示（图2），父本具有4条母本不具备的特征带，通过对126份杂交种样本的鉴定，其中8份杂交种样本具有1条特征带，27份杂交种样本具有2条带，41份杂交种样本具有3条带，1份杂交种样本具有4条带，而其余材料由于父本特征带不明显，暂不能评定为真杂交种，仍需进一步结合其他引物再次鉴定分析。可见，杂交后代在任何1对引物扩增后具有父本1条或多条特征带的均可评定为真杂交种。所以，由引物Tc 6初步鉴定，126份红豆杉杂交后代中已有77份真杂交种。而后，将引物Tc 6扩增出无父本特征带或特征带不明显的49份材料采用引物Tc 11进一步鉴定（图3），将具有父本特征带的22份后代评定为真杂交种。因此，评定杂交种的真实性需要采用多对引物结合鉴定，以便相互补充，以提高鉴定的真实性和杂交种的得率。 图2 EST-SSR引物Tc 6对部分红豆杉杂交种的筛选 FIG.2 The EST-SSR fingerprint amplified with primer Tc 9 in Taxus cuspidata hybrid 图3 EST-SSR引物Tc 11对部分红豆杉杂交种的筛选 FIG.2 The EST-SSR fingerprint amplified with primer Tc 11 in Taxus cuspidata hybrid 表1 EST-SSR分子标记引物序列 Table 1 Sequence of primer for EST-SSR molecular markers 引物 序列（5’ → 3’） 退火温度(℃) 基序 片段大小（bp） primer Sequence (5’ → 3’) Annealing (℃) Motif Size range TC 1 F：TACATGACAATGGCCTTCACAGC 59 (TA) 199～215 R：GTTTCTAAACAACAGCCCTCGAATGAGC TC 2 F：AGGGCTTGAGGTTGCTGGTACAC 59 (AC) 258～272 R：GTTTCTGACATAATCCACACCAAGGGAGC TC 3 F：TGAACGTGAACGAACTTGTCTCC 60 (TC) 324～328 R：GTTTCTCATGGGTTAGGCATGGACTTCAC TC 4 F：GCAAGCTGCACACTCCACAGTAG 60 (TA) 261～267 R：GTTTCTGGTGACACCCACGATTCTCAATAG TC 5 F：TTCGCATTTATAGATTCGGTCGG 59 (AG) 318～324 R：GTTTCTTCTCGATGTCTTCTACGCCTTGG TC 6 F：CTTGTTGCGAGAGAGAGGGAGTG 60 (GA) 243～249 R：GTTTCTAAACACAGCAGAGCCAAATGGTG TC 7 F：CTACGATGACACGCAAGAACACG 60 (AG) 104～116 R：GTTTCTTCTAAGTCTGCGTCCAGCTTTGG TC 8 F：TTCAGTGGTTTCATCTCTCATGACC 60 (CT)(CA) 150～158 R：GTTTCTTGCATCTCACCTTGTTAACTGTGC TC 9 F：CACAAGGATGAGTTTGGCCTCAG 59 (TCA) 265～310 R：GTTTCTTAGCGTGAACTGAAGGAGCTTGG TC 10 F：CCTTCGTACGTGCTTCCATCATC 60 (TCT)10 299～305 R：GTTTCTAACGCTTGGATCTAAATGAGGGC TC 11 F：CCTCGATTCTTAAACTGGAGTCGC 59 (TC)15 283～291 R：GTTTCTAATTCCATTCCTCCCAGCTCAAC TC 12 F： TTCTTATTCCTCTGTCCAGCGCC 59 (GA)9 134～138 R： GTTTCTAGCCATTCAAAGCGTTCCTTCTC 2.3 红豆杉杂交种群体EST-SSR扩增产物的多态性 本研究采用12对EST-SSR引物对99份红豆杉杂交种基因组DNA进行多态性扩增，共扩增出85条带，其中多态性条带71条，多态性比率为83.5%。多态信息含量（PIC）是表示微卫星DNA变异程度高低的一个指标，反映微卫星DNA多态性高低，其取决于检测的等位基因的数目和该基因的基因频率分布，一般来说，PIC＞0.5，多态性较高；0.5≥PIC≥0.25多态性适中；PIC＜0.25，多态性较低。而本研究12对EST-SSR引物的平均PIC值为0.668（0.502～0.924，见表3），表现出了较高的多态性；各个位点的平均观测杂合度（Ho）为0.440（0.257～0.587），但平均期望杂合度为0.659（0.523～0.796），可见，期望杂合度比观测杂合度要高。遗传分化系数（FST）是衡量中群间的遗传分化水平，0≤FST≤0.05，说明群体间遗传分化水平较低；0.05＜FST≤0.15，说明群体间遗传分化水平中等；0.15＜FST≤0.25，说明群体间遗传分化水平较高，FST＞0.25，表明群体间遗传分化程度*高；而本研究FST平均值为0.136（0.011～0.213），表明红豆杂交种群体间遗传分化程度适中，说明基因在杂交群体间流动较大，群体特征相对稳定。 表2 12对EST-SSR引物多样性 Table 2 Genetic diversity of 12 pairs of EST-SSR primers 引物 观测杂合度(Ho) 期望杂合度(He) 遗传分化系数(FST) 生物多态信息含量(PIC) Primer bserved heterozygosity Expected hete-rozygosity heritability coefficient polymorphism information content Tc 1 0.556 0.632 0.141 0.715 Tc 2 0.481 0.658 0.072 0.502 Tc 3 0.324 0.796 0.158 0.924 Tc 4 0.528 0.688 0.152 0.704 Tc 5 0.257 0.571 0.092 0.657 Tc 6 0.436 0.677 0.207 0.569 Tc 7 0.411 0.523 0.213 0.721 Tc 8 0.332 0.712 0.051 0.578 Tc 9 0.534 0.657 0.202 0.801 Tc 10 0.339 0.591 0.121 0.620 Tc 11 0.587 0.613 0.011 0.539 Tc 12 0.499 0.789 0.208 0.691 平均值(Mean) 0.440 0.659 0.136 0.668 3 讨论 本研究采用2对红豆杉多态性EST-SSR引物对126份杂交种材料进行鉴定分析，*先利用1对引物Tc 6对杂交种进行鉴定，随后采用引物Tc 11对将引物Tc 6不能评定为真杂交种的材料进行二次鉴定，*终从126份杂交后代中鉴定出99个真杂交种。在杂交种鉴定过程中共扩增出4种类型谱带，即“杂合型”、“父本型”、“母本型”和“其他型”。“杂合型”为杂交种同时具备父母本的特征带，该引物可以直接用于鉴定红豆杉杂交种；“父本型”和“母本型”为杂交种的扩增条带与父本或者母本的扩增条带一致，大多是亲本共同具有部分条带，而父本或母本具有另外一些扩增条带，杂交种亦相同，间接证明了“杂合型”的存在，其原因可能是由于亲本的基因组DNA中具有多个能与引物结合的位点，因而亲本扩增出多个扩增带，杂交种的条带也表现为“父本型”或“母本型”，该类引物可将杂交种和亲本鉴定出来；“其他型”为杂交种可能比亲本多了或少了一些条带，可能是由于在杂交种配子体形成过程中，染色体减数分裂期，同源染色体发生配对与交换，或DNA复制过程中碱基突变等情况，同时验证了杂交可使红豆杉的杂交后代产生多种变异，使红豆杉具有丰富的遗传多样性和表型多样性。 杂种优势是生物界的一种普遍现象，是性状表现不同的自交系杂交而产生的F1代，在一种或多种性状上优于双亲的现象。经过多年的不断深入研究，杂种优势已成为提高产量、改善品质、改良品种和增强抗性等的重要手段。杂种优势在玉米、高粱、水稻和小麦上得到了广泛的应用，而在红豆杉属植物上却少有报道，尤其现在东北红豆杉资源处于濒危状态，其中除人为因素破坏外，还包括东北红豆杉自身的繁殖条件限制以及对生长环境要求高等因素，所以，有必要通过杂交育种的方式选育出优势品种，以达到对东北红豆杉资源的保护及其资源更新，比如，本试验中的杂交种生长势较东北红豆杉要强，冬季夜色浓绿，偏向木本日本红豆杉，结果率较高等，而且杂交种的形态特征有分化，可根据其外形特点分别用于造林或景观盆栽等。 通过本文试验分析，EST-SSR分子标记用于红豆杉杂交种鉴定是可行的，是一种准确、快捷的分子生物学手段，为红豆杉杂种优势性状的应用、性状分离群体的鉴定分析以及种质资源的遗传改良提供科学依据。 [参 考 文 献] [1] 张宗勤, 刘志明. 红豆杉（第2版）[M]. 西北农林科技大学出版社, 2014: 1–210. ZHANG Z M, LIU ZH M. Hong Dou Shan (the second version) [M]. Northwest A&F University Press, 2014: 1–210. [2] 冯宁, 张宗勤, 刘志明, 等. 曼地亚红豆杉育苗技术研究[J]. 陕西林业科技, 2007, (4) : 165–168. FENG N, ZHANG Z Q, LIU ZH M, et al. Practical propagation technique of Taxus media [J]. Shaanxi forest Science and Technology, 2007, (4): 165–168. (In Chinese with English abstract) [3] 翟彦长,吴方星, 刘开邦,等. 庆元县南方红豆杉资源及育苗造林技术[J]. 现代农业科技, 2009, (7) : 55–57. ZHAI Y CH, WU F X, LIU K B, et al. Qingyuan County South of Taxus resources and forestation technique [J]. Modern Agricultural Science and Technology, 2009, (7): 55–57. (In Chinese with English abstract) [4] 郑轶琦, 宗俊勤, 薛丹丹, 陈 宣, 刘建秀. SRAP 分子标记在假俭草杂交后代真实性鉴定中的应用[J]. 草地学报, 2009, 17(2):135–140. ZHENG Y Q, ZONG J Q, XUE D D, et al. Application of SRAP markers to the identification of Eremochloa ophiuroides (Munro) hack hybrids [J]. Acta Agrestia Sinica, 2009, 17(2): 135–140. (In Chinese with English abstract) [5] 张宇,张晓芬,陈斌,等.辣椒EST-SR信息分析及标记开发[J]. 西北农业学报, 2010, 19(9):186–192. ZHANG Y, ZHANG X F, CHEN B, et al. Information and Exploitation of EST-SSRs Loci in Pepper (Capsicum annuum) [J]. Acta Agriculture Boreali-occidentalis Sinica, 2010, 19(9):186–192. (In Chinese with English abstract) [6] CHABANE K, ABLETT G A, CORDEIRO G M. EST versus genomic derived microsatellite markers for genotyping wild and cultivated barley [J]. Genetic?resources?and?crop?evolution, 2005, 52(7):287–296. [7] XU W W, SLEPER D A, KRAUSE G F. Genetic diversity of tall fescue germplasm based on RFLPs [J]. Crop Science, 1994, 34: 246–252. [8] RAJARAM V, NEPOLEAN T, SENTHILVEL S, et al. Pearl millet [Pennisetum glaucum(L)R.Br.]consensus linkage map constructed using four RIL mapping populations and newly developed EST-SSRs[J]. BMC Genomics, 2013, 14: 159–174. [9] SINGH R K, JENA S N, KHAN M S, et al. Development, cross-species/genera transferability of novel EST-SSR markers and their utility in revealing population structure and genetic diversity in sugarcane[J]. Gene, 2013, 2013,?524?(2):309-29. [10] 钟 声. 野生鸭茅杂交后代农艺性状的初步研究[J]. 草业学报, 2007, 16(1): 69–74. ZHONG SH. The agronomic acters of the hybrid progency of wild Dactylis glomerata [J]. Acta Prataculturae Sinica, 2007, 16(1): 69–74. (in Chinese with English abstract) [11] 林建丽, 朱正歌, 高建伟. 植物杂种优势研究进展[J].华北农学院, 2009, 24(增刊):46–56. LIN J L, ZHU Z G, GAO J W, Heterosis in Plant Research [J]. North China Academy of Agriculture, 2009, 24(supplement):46–56. (In Chinese with English abstract) [12] BISIS F A. An expanded genetic linkage map of Prunus based on an interspecific cross between almond and peach [J]. Genome, 2002, 45: 520–529 [13] LI G, QUIROS C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: Its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theoretical and Applied Genetics, 2001, 103: 455–461. [14] DANDAN C, KLAAS V, PETER G H K. The effect of hybridization on secondary metabolites and herbivore resistance: implications for the evolution of chemical diversity in plants [J]. Phytochemistry Reviews, 2011, 10: 107–117. [15] 凌 瑶, 张新全, 齐晓芳, 周莹洁, 刘 伟, 马 啸, 陈仕勇. 西南五省区及非洲野生狗牙根种质基于 SRAP 标记的遗传多样性分析[J]. 草业学报, 2010, 19(2): 196–203. LINGY, ZHANG X Q, QIX F, ZHOU Y J, LIU W, MA X, CHEN S Y. Genetic diversity of wild Cynodon dactylon germplasm from five province of southwest China and Africa detected by SRAP markers [J]. Acta Prataculturae Sinica, 2010, 19(2): 196–203. (In Chinese with English abstract) [16] BRENNAN A C, BARKER D, HISCOCK S J, et al. Molecular genetic and quantitative trait divergence associated with recent homoploid hybrid speciation: a study of Senecio squalidus (Asteraceae) [J]. Heredity, 2012, 108:87–95. [16] 陈 宣, 郭海林, 薛丹丹, 等. 结缕草属植物杂交后代的SRAP 分子标记鉴定[J]. 分子植物育种, 2008, 6(6): 1233–1238. CHEN X, GUO H L, XUE D D, et?al. Identification of Zoysia hybrids by SRAP analysis [J]. Molecular Plant Breeding, 2008, 6(6): 1233–1238. (In Chinese with English abstract) [18] 谢文刚, 张新全, 陈永霞. 鸭茅杂交种的 SSR 分子标记鉴定及其遗传变异分析. 草业学报, 2010, 19(2): 212–217. XIEW G, ZHANG X Q, CHEN Y X. Identification and genetic variation analysis of ordgrass hybrids (Dactylis glomerata) by SSR molecular markers. Acta Prataculturae Sinica, 2010, 19(2): 212–217. (In Chinese with English abstract) [19] BRENNAN?A C, TABAH?D A, HAMIS?SA, et?al. Sporophytic?self-incompatibility?in?Senecio squalidus (Asteraceae): S allele dominance interactions and modifiers of cross-compatibility and selling rates [J]. Heredity, 2011, 106:113–123. [20] 薛丹丹, 郭海林, 郑轶琦, 等. 结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定——SRAP分子标记[J]. 草业学报, 2009, 18(1):72–79. XUE D D, GUO H L, ZHENG Y Q, et al. Hybrid identification of progencies of Zoysia crosses by SRAP markers [J]. Acta Prataculturae Sinica, 2009, 18(1): 72–79. (In Chinese with English abstract) [21] 赵新, 文正华, 王永, 等.花椰菜杂交种科润F1代种子纯度的EST-SSR鉴定[J]. 种子检测, 2012,31(5):119–122. ZHAO X, WEN ZH H, WANG Y, et al. Purity Identification of Cauliflower F1 Variety Kerun by EST-SSR Marker [J].Seed detection, 2012, 31(5): 119–122.(In Chinese with English abstract) [22] 张庶, 周新成, 李利斌,等. 利用EST-SSR标记鉴定大白菜杂交种纯度的研究[J],天津农业科学,2010,16(6):1–4. ZHANG Z, ZHOU X C, LI L B, et al. Use of EST-SSR markers to identify the Seed Purity of Chinese Cabbage Cultivars [J]. Tianjin Agricultural Sciences, 2010, 16(6):1–4. (In Chinese with English abstract) [23] KRIK?H,?MACEL?M, KLINKHAMER?P G, et?al. Natural hybridization?between?Senecio jacobaea and Senecio jacobaea and Senecio aquaticus: molecular and chemical evidence [J]. Molecular?Ecology, 2004, 13(8):2267–2274. [24] PRANAVI B, STARAM G, YAMINI KN, et al. Development of EST-SSR markers in castor been(Ricinus communis L) and their utilization for genetic purity testing of hybrids [J]. Genome, 2011, 54(8): 684–691. [25] 李媛媛, 沈金雄, 王同华, 等. 利用 SRAP、SSR 和AFLP 标记构建甘蓝型油菜遗传连锁图谱[J]. 中国农业科学, 2007,40(6): 1118–1126. LI Y Y, SHEN J X, WANG T H, et?al. Construction of a linkage map using SRAP, SSR and AFLP markers in Brassica napus L. [J]. Scientia Agricultural Sinica, 2007, 40(6):1118–1126. (In Chinese with English abstract) [26] K?LLIKER R, STADELMANN F J, REIDY B, et al. Genetic variability of forage grass cultivars: a comparison of Festuca pratensis Huds, Lolium perenne L, and Dactylis glomerata L[J]. Euphytica, 1999, 106: 261–270. [27] 梁月荣, 田中淳一, 武田善行. 应用 RAPD 分子标记分析“晚绿”品种的杂交亲本[J]. 茶叶科学, 2000, 20(1) : 22–26. LIANG Y R, TANAKA J, TAKEDA Y. Parentage Analysis of Tea Clone “Okumidori” with RAPD method [J]. Journal of Tea Science, 2000, 20(1): 22–26. (In Chinese with English abstract) [28] HISAYO Y, KOICHIRO U, HIDENORI S, et al. The use of the S haplotype -specific F- box protein gene, SFB, as a molecular marker for S-haplotypes and self compatibility in Japanese apricot ( Prunus mume) [J]. Theoretical and?applied?genetics, 2003, 107(8): 1 357–1 361. Identification and genetic diversity analysis of Taxus cuspidata hybrids WANG Dan-dan1, ZHANG Yan-wen1, 2 (1. College of Agriculture, Eastern Liaoning University, Dandong 118003, China； 2. Grassland Research?Institute, Northeast Normal University, Changchun 130024, China) Abstract：In order to establish a rapid identification system and explore the genetic information for the hybrids of Taxus cuspidata, EST-SSR markers were used to identify and analyze the genetic diversity of Taxus cuspidata hybrids, which can provide the scientific basis for Taxus cuspidate’s germplasm resources protection and new varieties breeding. EST-SSR markers were used to amplify genomic DNA of 126 Taxus cuspidata hybrids and their parents, to analyze their polymorphism bands, which can identify the true or false hybrids. The results showed that 12 pairs of polymorphic markers were screened from the developed EST-SSR markers, which polymorphism rate was 83.5%, the mean value of PIC (Polymorphism information content) was 0.654, the mean value of Ho (observed heterozygosity) was 0.440, and the mean value of He (expected heterozygosity) was 0.659, so the He was larger than Ho, the average FST (genetic differentiation coefficient) was 0.136, which indicated that the genetic differentiation degree was moderate, the gene flow was large and its population acteristics were relatively stable among the hybrid populations； it had 99 true hybrids were identified from the 126 hybrid progenies with two polymorphic EST-SSR markers. So, it is feasible to use EST-SSR molecular markers to identify and analyze the genetic diversity of Taxus cuspidata hybrids. Key words: Taxus cuspidata； hybrid； EST-SSR molecular markers； phenotypic difference； genetic diversity